Totally Spies! raconte les aventures de trois amies et principales protagonistes : Samantha « Sam » Simpson, Clover Ewing et Alexandra « Alex » Vasquez, vivant ensemble en banlieue de Los Angeles, en Californie, et étudiantes au lycée Beverly High de Beverly Hills (dans les quatre premières saisons), puis à la fac de Mali-U (depuis la cinquième saison).

Étudiantes dans la vie de tous les jours, elles sont en réalité agents secrets, c'est-à-dire des espionnes professionnelles employées du WOOHP (signifiant World Office Of Human Protection), une organisation secrète de protection de l'humanité, située dans le centre-ville de Los Angeles. Les trois possèdent une même passion : le shopping au Groove ou sur Rodeo Drive. Leur patron, Jerry, ayant besoin de leurs services, les envoie en mission, après leur avoir fait revêtir des combinaisons intégrales moulantes en latex colorées (jaune pour Alex, rouge pour Clover, vert pour Sam) et leur fournit divers gadgets qui les aideront à mener à bien leurs enquêtes. Les héroïnes sont des jeunes filles modernes, indépendantes, sophistiquées, enthousiastes à la fois des aventures périlleuses, du maquillage et de la mode. 

Totally Spies! est une série d'animation inspirée de Drôles de dames, une série des années 1970. Le ton de la série est un mélange d'humour et d'action, et parodie les séries pour adolescents ainsi que les films d'espionnage (en utilisant les stéréotypes de ces deux genres). Il contient également de nombreuses références de films et de séries diverses, notamment la série Drôles de dames ou encore Totally Spice, une série diffusée en 1994. Par ailleurs, la série Totally Spies! a été considérée comme une version moderne des Drôle de dames. Dans l'épisode no 118 (le 14e de la saison 5) intitulé Totally Mystère ! est un cross-over entre la série Totally Spies! et la série Martin Mystère ; il met en scène une enquête conjointe entre le WOOHP via Alex, Clover et Sam et Le Centre via l'agent Martin Mystère.

En 2008, une série dérivée, intitulée SpieZ! Nouvelle Génération, est diffusée pour la première fois sur la chaîne télévisée TF1 et met en scène une équipe d'espion constituée de quatre jeunes enfants et composée de trois garçons et d'une fille recrutée par le WOOHP. Le réalisateur de la série, Stéphane Berry, explique qu'il voulait continuer l'univers des Totally Spies et « mettre au point une série un peu plus tournée vers les garçons ». En 2013, une sixième saison des Totally Spies! est arrivée en France dans TFou, l'émission de jeunesse de TF1 le mercredi 04 septembre 2013, en Belgique dans OUFTivi, l'émission de jeunesse de La Trois le mercredi 28 août 2013 et enfin en Suisse dans Mabule, l'émission de jeunesse de RTS Deux le mercredi 11 septembre 2013.